Подсемейство Sedoideae (Crassulaceae) флоры Сибири и российского Дальнего Востока (систематика, биоморфология, филогения)
С. Б. Гончарова
Глава 2. Материалы и методы
Материалом для данной работы послужили личные сборы автора, материалы гербариев и коллекций живых растений. Проанализированы гербарные коллекции очитковых Ботанического института им. В.Л. Комарова (LE), Главного ботанического сада РАН (MHA), Биолого-почвенного института ДВО РАН (VLA), Центрального сибирского ботанического сада (NS, NSK), отдела ботаники National Science Museum (TNS, Japan), Токийского университета (TI), Ботанического сада-института ДВО РАН (VBGI). Кроме этого широко использованы результаты собственных наблюдений в природе, а также гербарный и живой материал, собранный в ходе экспедиционных работ с 1989 по 2005 годы в районах Приморского и Хабаровского краев, Сахалинской области, островах Хонсю и Хоккайдо (Япония). Также изучены живые растения из коллекций Ботанического сада-института ДВО РАН, Центрального сибирского ботанического сада, Главного ботанического сада РАН, Botaniches Institut, Universität Köln (Германия) и из личной коллекции R. Stephensen (Англия).
В основе наших таксономических исследований лежит типологическая, умеренно политипическая концепция. Основной метод – традиционный морфолого-географический. В конспекте таксоны указаны в алфавитном порядке. Названия фитогеографических районов даны в соответствии с региональными сводками (Харкевич, 1985; Малышев, 2005). Для новых и впервые указанных для флоры России видов приведены описания.
Исследование морфологии пыльцы и поверхности семенной кожуры проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL S 5800 по стандартной методике. Съемку производили в 5-7 повторностях при различном увеличении (х70 – 4500).
При описании морфологии поверхности семян использована общепринятая терминология (Данилова, Кирпичников, 1985; Barthlott, 1981; Stern, 1992). Из внешних признаков семян наиболее важны форма, размер, характер поверхности семенной кожуры, расположение рубчика, наличие специализированных структур, способствующих распространению (различных придатков и выростов) (Эсау, 1980). Из признаков внутреннего строения – структура покровов, особенности запасающих тканей, морфология зародыша (Данилова, 1997). Вслед за W. Barthlott (1981, 1984) мы различаем первичную и вторичную скульптуры семенной кожуры. Первичная скульптура определяется: 1) общим очертанием клетки в плане (изодиаметрические или удлиненные); 2) формой наружной периклинальной стенки (выпуклая, вогнутая или плоская); 3) формой антиклинальных стенок (прямые, извилистые, утолщенные, не утолщенные); 4) очертаниями видимых на поверхности клеточных границ. Вторичная скульптура определяется главным образом морфологическими особенностями кутикулы (Кульбаева, 1992; Barthlott, 1981).
Для обозначения различно ориентированных антиклинальных стенок в отечественной литературе часто используют термины «радиальные» и «тангенциальные» стенки. Однако под понятие «радиальные», т.е. направленные по радиусу от центра семени наружу, подходят все антиклинальные стенки, а понятие «тангенциальные», т.е. располагающиеся в плоскости касания к поверхности семени, в сущности, соответствует периклинальным стенкам и используется некоторыми исследователями именно для их обозначения (Терехин, 1996; Колдаева, Гончарова, 2005; Corner, 1976). Следуя общепринятой в ботанике терминологии (Забинкова, Кирпичников, 1957; Данилова, Кирпичников; 1985; Stern, 1992), у клеток удлиненной формы антиклинальные стенки, максимально удаленные от центра клетки, мы называем дистальными, а приближенные к центру клетки и перпендикулярные дистальным – проксимальными.
Для изучения анатомического строения брали 5-10 семян, предварительно размягченных в смеси спирт-глицерин-вода (1:1:1). Срезы толщиной 5-15 мк готовили на замораживающем микротоме и заключали в глицерин-желатин (Паушева, 1974). Для приготовления полутонких срезов (2,5-3 мкм) образцы обезвоживали в ацетоне с последовательным повышением концентрации и заливали в синтетическую смолу. Срезы изготавливали при помощи стеклянного ножа, окрашивали Shiff-реагентом и толуидином голубым. Для выявления кутикулярных слоев использовали судан-III, карболовый фуксин по Цилю и мителеновый синий (Барыкина и др., 2004).
При анатомическом изучении стеблей очитковых образцы брали в средней и нижней частях побега. Срезы делали при помощи замораживающего микротома, окрашивали основным фуксином и заливали в глицерин-желатин. Для изучения элементов вторичной ксилемы проводили мацерацию частей стебля в азотной кислоте. Исследование срезов проводили при помощи светового микроскопа Axiolab.
Для характеристики жизненных форм, онтогенеза, сезонного развития в работе использованы общепринятые методики биоморфологии (Серебряков, 1952, 1962, 1964; Серебрякова, 1980; Хохряков, 1981, 1994; Мазуренко, 1986; Гатцук, 1994; Шафранова, Гатцук, 1994; Шафранова, 1980, 2001; Савиных, 2000; Шорина, 2000 а, б; и др.) и популяционной биологии растений (Работнов 1950; Уранов, 1975; Ценопопуляции, 1976, 1977, 1978; Динамика ценопопуляций, 1985; Смирнова, 1987).
Главным методом в изучении жизненных форм являлся анализ становления биоморфы в онтогенезе, сущность которого сводится к описанию жизненных форм взрослых растений, фаз морфогенеза и изучению моделей побегообразования (Шорина,1994). Для классификации биоморф нами использованы системы И.Г. Серебрякова (1964) и K. Raunkiaer (1934).
Для изучения онтогенеза были выбраны модельные виды, представляющие основные биоморфы.
Исследования эволюции жизненных форм в отдельных таксонах обычно ведутся путем реконструкции модусов морфологической эволюции на основе анализа морфогенетических рядов из родственных ныне живущих видов (Серебрякова, 1972). Такие ряды, как правило, не являются цепью предков-потомков и не могут быть приравнены к собственно филогенетическим. Хотя часто, в случае дивергентного образования жизненных форм в пределах узкой систематической группы, процесс формирования новых видов и биоморф, по-видимому, может совпадать.
При выделении редких видов учитывали число и размер населенных данными организмами участков в пределах всего ареала (распространенность) и плотность популяции в конкретных местообитаниях, степень концентрированности популяции (встречаемость) (Бигон и др., 1989). D. Rabinowitz (цит. по: Бигон и др., 1989) выделены 8 типов обычности и редкости (табл. 2), в соответствии с которыми мы классифицируем предположительно редкие виды.
Таблица 2
Классификация типов обычности и редкости [по Rabinowitz, цит. по: Бигон и др., 1989]
| Ареал |
Обширный |
Узкий |
| Специфичность местообитания |
Слабая |
Высокая |
Слабая |
Высокая |
| Размер локальной популяции: крупная, местами доминирующая |
Локально-обильный в широком ареале и различных местообитаниях |
Локально-обильный в широком ареале, но в специфическом местообитании |
Локально-обильный в нескольких местообитаниях, но с ограниченным ареалом |
Локально-обильный в специфическом местообитании с ограниченным ареалом |
|
Размер локальной популяции: небольшая, недоминирующая |
Редко встречающийся в широком ареале и нескольких местообитаниях |
Редко встречающийся в широком ареале, но в специфическом местообитании |
Редко встречающийся в нескольких местообитаниях, но с ограниченным ареалом |
Редко встречающийся в специфическом местообитании с ограниченным ареалом |
Для редких видов, в зависимости от степени риска, которому они могут подвергаться, и в соответствии с IUCN Red List Categories (1994), присвоена соответствующая категория: EX – исчезнувшие (extinct), EW (extinct in the wild) – исчезнувшие в природе; CR (critically endangered) – на грани исчезновения; EN (endangered) – угрожаемые; VU (vulnerable) – уязвимые; LR (lower risk) – низкая степень риска; DD (data deficient) – данных недостаточно.
При проведении молекулярно-филогенетических анализов на первом этапе из живых или сухих образцов выделялась общая геномная ДНК. Выделение и очистку общей ДНК клетки проводили с использованием QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), следуя инструкциям производителя. Участок рибосомного оперона, кодирующий 3' конец 18S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер 1 (ITS1), 5.8S рДНК, ITS2 и 5' конец 28S рДНК амплифицировали с помощью полимеризной цепной реакции (далее ПЦР), используя праймеры N-nc18S10 и C26A (Wen, Zimmer, 1996). Продукты ПЦР использовали для циклического секвенирования с набором BigDye v.3.1 (Applied Biosystems) и праймерами N18L18, N5.8S, ITS2, ITS4 (Wen, Zimmer, 1996). Определение нуклеотидных последовательностей обеих цепей ПЦР продуктов проводили на секвенаторе ABI PRIZM 310 (Applied Biosystems). Последовательности собирали, используя пакет программ Staden (Bonfield et al., 1995).
Для анализа филогенетических взаимоотношений между представителями подсем. Sedoideae создана матрица данных, включающая вновь полученные последовательности и взятые из базы данных GenBank (см. приложение 1). Нуклеотидные последовательности выравнивались вручную в программе SeaView (Galtier et al., 1996), следуя консервативным элементам первичной и вторичной структуры ITS региона (Gontcharova, Gontcharov, 2004).
Филогенетические деревья строили с использованием методов максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, далее ML), объединения соседей (Neighborhood-Joining, далее NJ) и максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, далее MP) в филогенетической программе PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002), а также Байесовского подхода (Bayesian Inference, далее BI), в программе MrBayes v3.0b3 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Эволюционные модели для ML и NJ анализов выбирали в программе Modeltest 3.04 (Posada, Crandal, 1998). Дистанции для NJ анализа рассчитывали через ML оптимизацию. Для ML и MP анализов использовали эвристический поиск оптимальной топологии. При BI анализе создавали 1 миллион генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждые 100 генераций, т.е. 10000 проб. Первые 500 проб (до выхода значений -lnL на плато) исключались из анализа как «burn-in». Устойчивость (статистическую поддержку) филогенетических деревьев в NJ и MP анализах оценивали методом бутстрепа (Felsenstein, 1985), используя 1000 бутстреп-реплик, и определяя апостериорные вероятности (Posterior Probabilities, далее PP) в BI. Значения процента бутстрепа (Bootstrap Percentage, далее BP) менее 50% и PP менее 0.90 не рассматривались и не указаны на рисунках. В бутстреп-анализе MP-деревьев в каждой реплике проводили 10 эвристических поисков оптимальной топологии со случайным порядком добавления таксонов.
Оригинальный рисунок А.Р. De Candolle www.illustratedgarden.org/mobot/rarebooks, Rhodiola pinnatifida nature.chita.ru.
Читать далее: главу 3
